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中国人自己的MSI检测 | 凡是过往 皆为序章

【2020-07-09】

        阅微基因在CE平台上有着丰富的研发经验,一直处于国内前沿,可以非常精准地对单核苷酸的微卫星状态进行判读。Microread MSI Panel(MR-panel3,6核心位点)在检测技术和临床应用上都有独特的优势,阅微基因结直肠癌微卫星不稳定状态检测试剂盒已经递交了国家第三类体外诊断试剂的注册申请。相信在不久的将来该试剂能够应用到临床,切实地为患者服务。


01  寻根——微卫星到底是什么?

        科学家们发现,在人类基因组中分布着许多重复的DNA序列,这些序列大多位于基因与基因之间,因此它们在不同个体间的序列长度虽然不尽相同,但是不会影响个体间遗传功能的改变。这些高度重复的核苷酸序列DNA通常被称为卫星DNA。
        微卫星(microsatellite,MS),也称为短串联重复序列(Short tandem repeat,STR),是人类基因组中少数几个核苷酸重复(通常是1~6个,或者更多)的现象。
        STR 具有种属特异、遗传稳定的特点,使其在人类基因组遗传图谱的制作、癌症诊断、亲缘关系分析、法医学个体识别等领域都得到了广泛的应用。
02  必然——MSI与错配修复
        MMR基因突变或者基因修饰(如甲基化),导致MMR蛋白功能缺失,当机体中的错配修复功能发生缺陷时,由于微卫星多次重复的特点更倾向出现复制错误,导致微卫星的缺失或插入,从而发生了微卫星不稳定(microsatellite instability,MSI)。
        这种不稳定的状态连同MMR基因的缺失导致细胞内突变累积加速,进而引起致癌或抑癌基因表达调控变化,发生癌变。



        微卫星不稳定状态可以用来进行肿瘤辅助诊断。
        在结直肠癌的分子分型中,微卫星不稳定状态是一种重要的分型工具,帮助临床医生就疾病提出诊断和治疗方案。


来源:World J Gastrointest Oncol. 2013 Feb 15; 5(2): 12–19.

        在《结直肠癌及其他相关实体瘤微卫星不稳定性检测中国专家共识》中,推荐对所有结直肠癌患者进行MMR蛋白/MSI检测,以明确患者是否属于林奇综合征。
        林奇综合征是一种常染色体显性遗传疾病,由于错配修复基因的遗传性变异导致。90%以上的林奇综合征患者发生了微卫星不稳定的情况。目前的林奇综合征的筛查面临着漏诊的问题,除了扩大对林奇综合征筛查的肿瘤谱之外,提高试剂的灵敏性,降低漏诊率也是临床急需解决的问题。

03  疑问——如何选择微卫星检测位点?
        MSI确定除直接检测MSI外还可以通过MMR基因突变(或表观遗传学修饰分析)、二代测序方法以及MMR免疫组化检测实现。其中免疫组化检测最为简便,并且可以提供基因异常的线索。但免疫组化的判读需要检验医生具有比较丰富的阅片经验和病例积累,二代测序从成本和周期上暂时不具有优势。
        用毛细管电泳的方法检测微卫星不稳定位点,面临的首要问题是“测哪个/哪些微卫星位点呢?”
为此,从1993年Aaltonen等人首次在家族性遗传性结直肠癌(HNPCC)中发现高频率的MSI现象(约90%的Lynch综合征患者存在MSI-H现象)开始,人们就开始寻找灵敏度高、特异性好的检测靶标。
        选择合适的微卫星位点是MSI检测准确性的重要因素之一。结合文献研究和行业研究,汇总MSI检测的影响因素如下:
  • 微卫星类型(单-,双-,三-核苷酸):单核苷酸的微卫星具有更高的灵敏性,有研究表明随着微卫星核苷酸数量的增加,灵敏性呈逐渐下降的趋势;
  • 微卫星位点数量:并不是数量越多越好,增加微卫星可能会降低检测的灵敏性;
  • 微卫星在肿瘤中的不稳定检出率:阳性率越高的微卫星趋于有更高的灵敏性;
  • 微卫星位点的多态性:更倾向于单态的微卫星,可以降低结果判读的复杂性,增加判读的准确性;
  • 检测体系的兼容性:待检测的微卫星是否可以做到单管扩增,以实现操作简便、减少误差的目的。

04  历史——站在巨人们的肩膀上
        早在1997年,在美国国家癌症研究所(National Cancer Institute,NCI)提出了5个微卫星的评价系统,包括:BAT-25,BAT-26,D5S346,D2S123,D17S250,其中D5S346, D2S123, D17S250为双核苷酸微卫星。
        2002年,Suraweera等的研究发现双核苷酸位点在MSI-H的检出率只能到60%~80%,而且双位点核苷酸本身更趋于不稳定,对结果图谱判读的难度增大,容易得到错误的分类结果。他们研究出的pentaplex体系,含有5个单核苷酸位点(BAT-25,BAT-26,NR-21,NR-22,NR-24), 检测灵敏性均在95%以上。在该团队后续的研究中,NR-22由于扩增兼容性问题被NR-27替代。
        2004年Bethesda指南中指出了pentaplex体系的高灵敏性和特异性,同时指南中还提出可以选择一些多核苷酸位点作为内对照防止样品间的混淆。
        2006年,国外某厂家(以下简称“A公司”)的7位点MSI检测体系出现,包括5个单核苷酸位点(BAT-25,BAT-26,MONO-27,NR-22,NR-24)和2个对照位点(PentaC,PentaD)。该体系中使用MONO-27替代了NR-22。至此,基于PCR法中的5~7个标志位点组合被认定为PCR-MSI检测的金标准。



        结合前辈们的研究数据和行业指南,我们最终选择了一个6种单核苷酸重复的组合,如下:



        这些位点涵盖了几乎所有的经典可靠的微卫星位点,如下图:



        为什么单核苷酸重复位点具有更高的灵敏度和特异性呢?
        为此我们也进行了一些探究,可能的原因如下:
        A:单核苷酸重复位点更倾向单态
        单核苷酸微卫星通常存在于一些基因的非翻译区或5’UTR或3’UTR 区域,由于一些不明确的原因,有些单核苷酸的微卫星是更倾向于单态的。研究表明BAT-25,BAT-26,NR-21,NR-22,NR-24位点在高加索人中的多态性均不到1%,是接近单态的位点。
        阅微基因前期在327个中国人群中的研究发现,以下6个位点的杂合度在1%~10%之间。



        B:选择的Microread MSI Panel与基因转录调控功能相关

        同时,这些位点所在的基因参与了基因转录调控功能、肿瘤的发生和凋亡及错配修复等,进一步验证了微卫星不稳定状态可能通过影响上述基因的表达调控引发肿瘤的发生。

        C:Microread MSI Panel与染色体的覆盖情况

        为了使这些微卫星位点能够更好的代表肿瘤的微卫星不稳定状态,在保证检测简洁、灵敏度、特异性好的基础上,这些位点在染色体上的分布如下图,我们尽可能覆盖不同的染色体。




05  金标准——凡是过往 皆为序章
        为了验证六位点MSI panel的灵敏度与特异性,阅微基因进行了大量临床样本的验证。我们从微卫星的位移值检测的准确性和漏诊率等不同方面,对试剂盒的性能进行了分析和验证。

        A:微卫星不稳定位移值与MSI检测
        微卫星的位移值,指的是发生微卫星不稳定的样本中,某一个STR位点肿瘤组织与正常组织核苷酸重复数之间的差异。
        在354个肿瘤样本中,经IHC检测,其中有171例为MSI-H,183例为MSS/MSI-L。从图中可以看出,微卫星位移在MSI-H与MSS/MSS-L中差异显著,在MSS中的位移接近基线水平,NR-27和BAT-26的位移最大,推测会有较高的灵敏性。



下图中可以直观的看到每个个体的位移情况,1-171为MSI-H样本中的位移情况,172-354为MSS/MSI-L样本中的位移情况,通过比较位移可以对不同的微卫星状态进行判断,说明通过毛细管电泳检测位移的方法,可以轻松实现对个体MSI状态的分析。




        B:单核苷酸重复位点不同组合panel与MSI检测
        阅微基因参考A公司的体系构建了MR-Panel1(无NR-27),参考Bethesda推荐的pentaplex体系构建了MR-Panel2(无MONO-27),整合了A公司和pentaplex体系构建了MR-panel3(6核心位点),比较3个不同panel的检测准确性和特异性。





        中国人群中,从单个位点来看,NR-24灵敏性较低,但特异性为100%。NR-27的灵敏性、特异性、准确性是6个位点中最佳的。3个panel的检测准确性都在95%以上,以MR-Panle3的灵敏性和准确性最高。当采用MR-Panle3时,检测的漏诊率为2.34%,相比于MR-Panle1和MR-Panle2分别降低了1.75%和2.34%。




        C:六单核苷酸重复位点的Microread MSI Panel的中国人群验证结果
        658例临床结直肠癌样本及其对应癌旁组织,分别使用Microread MSI Panel和免疫组织化学方法进行对比检测,结果如下:



        和免疫组织化学的结果相比,总符合率为96.61%(95%CI:94.15%~98.24%),Microread MSI Panel具有很高的灵敏度和特异性。


        阅微基因在CE平台上有着丰富的研发经验,一直处于国内前沿,可以非常精准地对单核苷酸的微卫星状态进行判读。Microread MSI Panel(MR-panel3,6核心位点)在检测技术和临床应用上都有独特的优势,阅微基因结直肠癌微卫星不稳定状态检测试剂盒已经递交了国家第三类体外诊断试剂的注册申请。相信在不久的将来该试剂能够应用到临床,切实地为患者服务。

参考文献
[1]中国临床肿瘤学会结直肠癌专家委员会,中国抗癌协会大肠癌专业委员会遗传学组, 
中国医师协会结直肠肿瘤专业委员会遗传专委会.《结直肠癌及其他相关实体瘤微卫星不稳定性检测中国专家共识》.
[2]Jafar N Nojadeh, et al. Evaluation of Microsatellite Instability in Tumor and Tumor Marginal Samples of Sporadic Colorectal Cancer Using Mononucleotide Markers. EXCLI Journal, 2018; 24(17): 945-951. 
[3]Gasper Berginc , Damjan Glavac. Rapid and Accurate Approach for Screening of Microsatellite Unstable Tumours Using Quasimonomorphic Mononucleotide Repeats and Denaturating High Performance Liquid Chromatography (DHPLC). Dis Markers. 2009;26(1):19-26.
[4]Buhard O, et al. Quasimonomorphic mononucleotide repeats for high-level microsatellite instability analysis. Dis Markers. 2004;20(4-5):251-7.
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[6]A Loukola, et al. Microsatellite Marker Analysis in Screening for Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer (HNPCC). Cancer Res. 2001;61(11):4545-9. 
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[8]Kathleen M Murphy, et al. Comparison of the Microsatellite Instability Analysis System and the Bethesda Panel for the Determination of Microsatellite Instability in Colorectal Cancers. J Mol Diagn. 2006;8(3):305-11. 
[9]Jeffery W Bacher, et al. Development of a Fluorescent Multiplex Assay for Detection of MSI-High Tumors.2004;20(4-5):237-50. 


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